Protocolo de descelularização de traqueias suínas com desoxicolato de sódio a 4%: 24 h bastam para a submucosa, mas condrócitos e resíduos de detergente persistem

Um único ciclo de 24 h foi suficiente para descelular a submucosa, mas condrócitos permaneceram na cartilagem e resíduos de detergente reduziram a viabilidade celular em extratos não diluídos.

Estudo experimental do grupo da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo otimizou um protocolo de descelularização de traqueias suínas com desoxicolato de sódio (SDC) a 4%, testando até 10 ciclos consecutivos de 24 h (24 a 240 h de exposição acumulada). O primeiro ciclo já reduziu o DNA residual em 99,3% na submucosa, com valores abaixo de 50 ng/mg de tecido seco, sem ganho adicional nos ciclos seguintes; na cartilagem, os condrócitos permaneceram. A arquitetura da matriz e as propriedades biomecânicas transversais foram preservadas, mas houve perda de colágeno e elastina, alterações em parâmetros longitudinais e detecção de SDC residual, com viabilidade celular abaixo de 70% nos extratos não diluídos.

Contexto

A reconstrução de defeitos traqueais extensos continua sendo um desafio em cirurgia torácica pela complexidade estrutural e funcional da traqueia e pelas limitações dos substitutos disponíveis. Matrizes extracelulares descelularizadas são uma estratégia promissora, pois a preservação dos componentes e da arquitetura da matriz pode criar um microambiente favorável à adesão, migração, proliferação e diferenciação celular. A eficiência da descelularização depende de concentração do reagente, temperatura, agitação e tempo de exposição, e condições agressivas demais podem alterar proteínas estruturais, glicosaminoglicanos, fatores bioativos e propriedades biomecânicas. O SDC é usado em protocolos traqueais, mas a exposição prolongada pode comprometer a matriz. Os autores argumentam que a remoção completa dos condrócitos pode não ser necessária, dado o baixo potencial imunogênico descrito para essas células em estudos experimentais, e que a descelularização pode ser direcionada aos componentes celulares de maior potencial imunogênico, como epitélio, tecido glandular e pericôndrio.

Como foi feito

Estudo experimental com 100 traqueias de suínos Large White de 10 meses e cerca de 100 kg, obtidas em abatedouro e transportadas em gelo ao laboratório em até 24 h, aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (CEUA-FMUSP, protocolo 1673/2021). Sessenta e três traqueias foram preparadas manualmente em 630 fragmentos de aproximadamente 3,85 cm2; 600 foram distribuídos em tubos cônicos de 50 mL, 10 fragmentos por tubo, seis tubos por ciclo (n = 6 unidades experimentais), e submetidos a 10 ciclos de 4% SDC sob agitação constante a 180 rpm e 37 °C, com três lavagens em água deionizada entre ciclos; 30 fragmentos permaneceram in natura como controle. Ao fim do último ciclo de cada condição, houve lavagens sequenciais em água deionizada e NaCl 0,9%, tratamento com DNase I a 30 µg/mL por 6 h a 37 °C, nova sequência de lavagens e lavagem prolongada em água deionizada por 40 h com trocas a cada hora. A eficiência foi avaliada por quantificação de DNA residual, histologia com H&E e quantificação de SDC residual em todos os ciclos; C1, C2 e C10 (24, 48 e 240 h) foram selecionados para caracterização da matriz (colágeno solúvel e insolúvel, glicosaminoglicanos e elastina), citocompatibilidade e análise biomecânica. Para a biomecânica, 37 traqueias adicionais foram alocadas e corpos de prova da parede anterior traqueal, nas orientações longitudinal e transversal, em formato de osso de cachorro tamanho V conforme ASTM D638-02a, foram submetidos a ensaio de tração uniaxial em máquina Instron 3365 a 10 mm/min, imersos em solução salina a 36 °C, com cinco espécimes de cinco traqueias diferentes por grupo e por direção. A citocompatibilidade foi testada em células BEAS-2B expostas a extratos de 25%, 50%, 75% e 100% por 24, 48 e 72 h, com viabilidade ≥70% considerada não citotóxica; o limiar de citotoxicidade do SDC foi determinado por curvas de concentração-resposta.

O que encontraram

No tecido traqueal remanescente após a retirada da submucosa, a descelularização reduziu o DNA em 93,7% em relação ao controle (ANOVA, p < 0,001; Bonferroni, p < 0,001 para todas as comparações), sem diferenças entre C1 e C10, mas com valores acima de 50 ng/mg de tecido seco em todos os ciclos. Na submucosa, a redução foi de 99,3%, com valores abaixo desse limiar desde o primeiro ciclo e sem diferenças entre os ciclos; o DNA residual foi significativamente menor na submucosa do que no tecido traqueal em todos os ciclos (ANOVA de duas vias, efeito de tipo de tecido p < 0,001; efeito de ciclo p = 0,946; interação p = 0,946). A histologia mostrou redução acentuada de componentes celulares na submucosa já em C1, padrão semelhante nos ciclos seguintes, condrócitos persistentes na cartilagem e arquitetura tecidual preservada.

Referência

Dos Santos ES, da Silva RS, de Morais SDS et al.. Optimization and Characterization of a Physicochemical Decellularization Protocol for Porcine Tracheal Scaffolds. Bioengineering (Basel) 2026.

DOI: 10.3390/bioengineering13101181 · PubMed: 42939036

Texto completo gratuito: doi.org, licença CC BY.

Matéria escrita pelo Fôlego a partir do texto completo em acesso aberto.